Vescicole extracellulari del liquido sinoviale: un ruolo chiave nella ricerca e nel trattamento delle infiammazioni articolari?

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Giovedì 03 Novembre 2022 - 12:00

Vescicole extracellulari del liquido sinoviale
Data di pubblicazione: 
Mercoledì 02 Novembre 2022

Il liquido sinoviale è il fluido che riduce al minimo l'attrito all'interno della capsula delle articolazioni sinoviali. Le articolazioni sinoviali sono l'articolazione più comune nel corpo umano: per esempio l'anca, il ginocchio e il gomito. Queste articolazioni hanno una propensione alle artriti, come l'artrite reumatoide e l'osteoartrite. Poiché il liquido sinoviale è il biofluido che circonda i tessuti danneggiati/infiammati in queste condizioni, la sua composizione nelle articolazioni colpite può essere la chiave per comprendere la patogenesi e la malattia. La risposta a questi quesiti potrebbe essere data con l'aiuto delle vescicole extracellulari derivate dal liquido sinoviale (SF-EV), che stanno suscitando molto interesse nei ricercatori. Le EV sono vescicole di dimensioni nanometriche in cui proteine, acidi nucleici e piccole molecole della cellula da cui traggono origine sono incapsulate all'interno di un doppio strato lipidico. Le EV sono cellule cargo, che possono essere consegnate a cellule prestabilite (cellule target), al contatto con le quali possono verificarsi diverse reazioni. Queste caratteristiche rendono le vescicole extracellulari molto interessanti come biomarcatori, ma le rendono anche vitali per comprendere la patogenesi di malattie, come quella, nel caso specifico, delle malattie delle articolazioni sinoviali. In questo articolo si discute della composizione del liquido sinoviale e del suo impatto sull'isolamento delle vescicole, per poi evidenziare lo stato della ricerca sulle SF-EV.

La composizione del liquido sinoviale

Il principale tipo di cellula nel liquido sinoviale sono le cellule immunitarie, che si ritiene siano una delle principali fonti di SF-EV.1 Come nella maggior parte delle condizioni infiammatorie, l'infiammazione dell'articolazione sinoviale è associata a una significativa infiltrazione di leucociti, il che rende le vescicole extracellulari di derivazione immunitaria l'obiettivo principale della ricerca SF-EV.2 Per consentire un isolamento efficace e puro delle vescicole extracellulari, è essenziale una conoscenza di base delle componenti non-EV del liquido sinoviale.

Come il liquido cerebrospinale, il liquido sinoviale è un ultrafiltrato del plasma e ha circa un terzo della concentrazione totale in proteine ​​plasmatiche.3 Sebbene il contenuto proteico sia relativamente basso, la concentrazione di SF-EV è sconosciuta. Ciò significa che il rapporto EV-proteina non può attualmente essere paragonato a quello del plasma, che è il biofluido in base al quale è stata ottimizzata la maggior parte dei metodi di isolamento EV. Ciò che è noto essere diverso dal plasma è la viscosità del liquido sinoviale, che è viscoso come l'albume crudo. La viscosità è il più grande fattore di differenziazione del liquido sinoviale rispetto ad altri fluidi corporei; questa particolare viscosità è richiesta per avere proprietà lubrificanti all'interno delle articolazioni. La viscosità è principalmente dovuta alla presenza dell’acido ialuronico viscoelastico, che è presente come polimero glicosaminoglicano ad alto peso molecolare.4 Insieme alla lubricina, l’acido ialuronico è secreto da cellule simili a fibroblasti della membrana sinoviale, che rivestono la parte rivolta verso l'interno, dal lato della capsula articolare.5 Sia l’acido ialuronico che la lubricina contribuiscono alla viscosità non newtoniana del liquido sinoviale, che vede un assottigliamento del liquido sinoviale soggetto a forze di taglio.6 Anche la viscosità è un parametro che risulta alterato nei soggetti malati.7 Ciò ha implicazioni per l'isolamento delle vescicole extracellulari nel caso si utilizzino metodi che sono influenzati dalla viscosità, come ad esempio l'ultracentrifugazione (UC).

Considerazioni sull'isolamento di vescicole extracellulari da liquido sinoviale

Uno dei fattori da tenere in considerazione quando si valutano le metodologie per isolare le vescicole extracellulari dal liquido sinoviale è l'acido ialuronico, la cui presenza ha portato anche all'utilizzo della ialuronidasi nei flussi di lavoro. Tuttavia, l'unico impatto è l'aumento di 10.000xg di particelle di pellet e la diminuzione di 100.000xg di particelle di pellet, mentre aumenta in modo specifico il rilevamento di CD44+ EV evidenziata da analisi da citofluorimetro.8 LeSF-EV possono anche trovarsi rivestite di acido ialuronico.9 Con un solo studio attualmente pubblicato su questo argomento, l'impatto della ialuronidasi sul recupero delle vescicole extracellulari non ha ancora preso effettivamente piede. Ci sono, tuttavia, diverse prove che il metodo di isolamento EV utilizzato abbia effettivamente un impatto sulla qualità del campione isolato di EV. 

.Foers et al. (2018) hanno cercato di confrontare l'Ultracentrifugazione convenzionale e l'UC a gradiente di densità (DG-UC) con la cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) per l'isolamento di EV dal liquido sinoviale.10 UC e DG-UC hanno co-isolato, senza grandi differenze, grandi quantità di lipoproteine ​​​​ad alta densità ed era rintracciabile materiale amorfo evidenziato da analisi TEM. Con la SEC, i marcatori delle lipoproteine ​​ad alta densità erano separati nettamente dai marcatori delle EV e la TEM restituiva immagini generalmente più pulite: ciò significa che la SEC è risultata essere la tecnica più efficace.10 Sfortunatamente, la SEC utilizzata in questo studio ha richiesto molto tempo per essere eseguita (>150 minuti), rendendo la tecnologia non adatta per un numero elevato di operazioni, e comunque con impatti negativi anche per ricerche su campioni non numerosi10. Si è comunque constatato che la SEC, se utilizzata con le colonnine qEV, può richiedere fino a 15 minuti, rendendo il processo molto più scalabile. La velocità delle colonne qEV è stata confermata in uno studio di Chen et al. (2022) in cui sono state confrontate UC, precipitazioni e qEV SEC. Le colonne qEV sono risultate il metodo di isolamento più rapido e più puro, in grado di rimuovere la maggior parte della contaminazione proteica.11 A differenza delle colonne SEC a lunga corsa utilizzate da Foers et al. (2018), colonne qEV utilizzate da Chen et al. (2022) non hanno evidenziato reti di proteine fibrose nelle frazioni EV. Quindi la letteratura non solo suggerisce che la SEC sia il metodo preferibile, ma che, più in particolare, siano preferibili le colonne qEV rispetto ad altri strumenti che usano la SEC.10,11

Artriti e vescicole extracellulari: la ricerca sul liquido sinoviale

Sebbene esistano diverse artriti, le più diffuse sono l'artrosi (osteoartrite) e l'artrite reumatoide. L'artrite reumatoide è descritta come un'artrite infiammatoria e, se da una parte è vero che l'infiammazione gioca un ruolo maggiore nella patogenesi dell'artrite reumatoide, dall'altra parte questo aspetto diminuisce in modo alquanto significativo il ruolo dell'infiammazione nel perpetuare l'osteoartrite. Numerosi studi sulle SF-EV hanno confrontato le due forme di artrite, spesso con l'osteoartrite usata come una sorta di controllo a causa di vincoli etici che limitano la raccolta di liquido sinoviale da pazienti sani. Pertanto, in questi studi potrebbero non essere rilevate alcuni eventi sule vescicole extracellulari in una o entrambe le condizioni. Nonostante gli svantaggi del confronto tra artrite reumatoide e osteoartrite, diversi studi hanno scoperto che esiste un numero significativamente più alto di EV nell'artrite reumatoide rispetto all'osteoartrite.12-14 Ciò suggerisce che le SF-EV abbiano un ruolo significativo nell'artrite reumatoide.

La maggior parte degli studi sulle SF-EV si sono concentrati sull'identificazione dell'origine delle vescicole extracellulari, concentrandosi principalmente sui marcatori delle cellule immunitarie. Questi studi hanno dimostrato che esiste un arricchimento nell'artrite reumatoide per le vescicole extracellulari da fibroblasti13, cellule T regolatorie12, cellule T helper CD4*15, cellule T citotossiche CD8*1,15, monociti15,16, piastrine17 ed entrambi i granulociti in generale15 e i neutrofili in particolare12,13, 16. Al contrario, l'artrosi è arricchita per le vescicole extracellulari derivate ​​​​da cellule T attivate18, macrofagi18, cellule B18 e cellule natural killer18. Ma qual è il ruolo di queste vescicole extracellulari di derivazione immunitaria?

Le proteine ​​nelle SF-EV di persone con artrite reumatoide sono arricchite con le proteine ​​del complemento e della cascata della coagulazione e con quelle coinvolte nella chemiotassi.14 Uno studio19 ha scoperto che le SF-EV di pazienti con artrite reumatoide fanno sì che le cellule simili ai fibroblasti della membrana sinoviale producano una maggiore quantità di citochine e altre proteine ​​con ruoli noti nell'osteoartrite e nell'artrite reumatoide.20-22 Quando si confrontano i cambiamenti della proteina delle SF-EV nell'artrite reumatoide rispetto all'osteoartrite tra due studi13,14 (Figura 1), la proteina upregolata più presente nelle EV dell'artrite reumatoide in entrambi i set di dati è risultata essere il biomarcatore dell'artrite reumatoide S100A9.23,24 Un'altra proteina upregolata nelle SF-EV dell'artrite reumatoide è la vimentina (Figura 1). La forma citrullinata della vimentina è presente negli SF-EV25 ed è un importante autoantigene in un sottogruppo di pazienti con artrite reumatoide.26,27 È stato anche dimostrato che altre proteine ​​in questo elenco (Figura 1) sono coinvolte o alterate nell'artrite reumatoide. È possibile, quindi, che le SF-EV nell'artrite reumatoide perpetuino l'infiammazione.

Figura 1. Un confronto dei livelli di proteine ​​nelle vescicole extracellulari derivate ​​dal liquido sinoviale di persone con artrite reumatoide e osteoartrite. Dati provenienti da due studi di proteomica13,14 Indicati come n come log2 fold change (artrite reumatoide vs osteoartrite).
 
Inoltre, queste SF-EV nei pazienti con artrite reumatoide contengono anche miRNA, noti per avere come target i percorsi delle citochine, che sono altamente arricchiti per la proteina antinfiammatoria della zona della gravidanza, suggerendo un coinvolgimento nella modulazione dell'infiammazione.14,28 Questa dicotomia tra proprietà pro- e anti- infiammatoria potrebbero coesistere nelle singole vescicole extracellulari o potrebbero essere separate in diverse sottopopolazioni di vescicole extracellulari, provenienti da differenti celle di origine. È stato dimostrato che le SF-EV di medie dimensioni da persone con osteoartrosi rappresentavano la maggior parte delle EV derivate ​​​​da cellule B, mentre le EV grandi e piccole erano più arricchite di EV derivate ​​​​da macrofagi, suggerendo che la distorsione nelle dimensioni degli EV tra gli studi può alterare la proporzione di diversi tipi di vescicole extracellulari nei campioni isolati.18 Gli studi sul campo attualmente utilizzano un'ampia gamma di tecniche di isolamento di vescicole extracellulari  che probabilmente contribuiscono alla mancanza di consistenza osservata tra gli studi isolando popolazioni diverse. Questa inconsistenza potrebbe essere migliorato mediante l'adozione di una procedura standardizzata che ha dimostrato di funzionare bene nella separazione del fluido sinoviale: stiamo parlando delle colonnine qEV di Izon Science.
Questioni chiave per la ricerca sulle EV da liquido sinoviale

Per poter traslare i risultati della ricerca alla produzione di farmaci o altro che apportino benefici clinici, è necessario rispondere almeno alle seguenti domande chiave:

  1. Le vescicole extracellulari mostrano marcatori di cellule immunitarie prodotte dalle medesime cellule immunitarie? Quando una EV è positiva a un marcatore di cellule immunitarie, si presume che la cellula immunitaria in questione sia l'origine dell'EV. Tuttavia, non è ancora certo se questo sia vero o se questi EV in realtà provengano da altre cellule che esprimono in modo anomalo queste proteine ​​come parte della patologia articolare.
  2. Stiamo forse perdendo biomarcatori potenzialmente vitali o candidati al trattamento, dovuto alla mancanza di controlli su individui sani? Quasi tutti gli studi che esaminano le SF-EV trattano l'artrosi come campioni di controllo, a causa dei vincoli etici. Eppure, la disregolazione immunitaria è chiaramente presente nelle articolazioni dell'osteoartrosi.
  3. La standardizzazione dei metodi di isolamento delle SF-EV migliorerà la consistenza tra gli studi? Attualmente vi è una sostanziale discordanza in merito a quali siano le principali cellule sorgente di EV che contribuiscono a diversi studi. È chiara la necessità di coorti più ampie, metodi standardizzati e revisioni sistematiche.

Gli studi sulle SF-EV hanno indicato un potenziale ruolo infiammatorio (e/o antinfiammatorio), ma l'impatto delle SF-EV sui tessuti circostanti deve ancora essere determinato in maniera adeguata. La domanda è: queste minuscole vescicole possono contenere la chiave per nuove terapie mirate alle condizioni infiammatorie delle articolazioni?

Fonti
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