Vescicole extracellulari e ricerca sul Glioblastoma: un approfondimento sul campo

Venerdì 10 Settembre 2021
Da sinistra a destra: Gwennan André-Grégoire Laetitia Guevel, Julie Gavard e Quentin Sabbagh.

Da sinistra a destra: Gwennan André-Grégoire Laetitia Guevel, Julie Gavard e Quentin Sabbagh.

Condividiamo un approfondimento sulla ricerca del ricercatore francese Dr Gwennan André-Grégoire, che sta lavorando per svelare la fisiopatologia correlata alle vescicole extracellulari del glioblastoma multiforme

Il glioblastoma multiforme (GBM) è un tumore primario altamente aggressivo ed eterogeneo che si presenta nel sistema nervoso centrale ed è il tumore cerebrale più comune negli adulti.1,2 È molto difficile da trattare ed è associato a un'aspettativa di vita molto breve.3 Gli sforzi terapeutici sono stati vanificati da diverse occorrenze, tra le quali il rapido tasso di crescita del GBM, l'eterogeneità molecolare, la resistenza al trattamento e la capacità di infiltrarsi nelle strutture cerebrali vitali.4 Comprendere i meccanismi cellulari e molecolari alla base della progressione della malattia da GBM – e identificare i primi biomarcatori – sono perciò le priorità principali per molti scienziati nel campo della ricerca sul cancro.

La dottoressa Gwennan André-Grégoire, la cui attività è basata in Francia, è un ricercatore impegnato a svelare la fisiopatologia della GBM. Grazie al lavoro con il gruppo di ricerca della dottoressa Julie Gavard, la Dr.ssa Gwennan sta esplorando le vescicole extracellulari (EV) come potenziali fattori che mediano l'aggressività del GBM e la resistenza al trattamento. Izon Science ha intervistato la Dr.ssa Gwennan sulla sua carriera nella ricerca EV-GBM, delle sfide e delle speranze nel campo della ricerca sul cancro, correlata alle EV.

ICO e CRCINA: una rete di collaborazioni

Dopo il dottorato e la posizione post-dottorato a Parigi, Gwennan ha ottenuto un'opportunità post-dottorato presso il Centro di ricerca sulla cancerologia e immunologia di Nantes-Angers (CRCINA) nel team "Signaling in Oncogenesis, Angiogenesis and Permeability" (SOAP) guidato dalla dott.ssa Julie Gavard. Il gruppo è affiliato con l'Università di Nantes, l'Istituto nazionale di sanità e ricerca medica (Inserm) e il Centro nazionale francese per la ricerca scientifica (CNRS).

Il gruppo di Gavard mira a collegare la loro ricerca alla clinica medica, e si concentra sulla biologia cellulare correlata all'EV e sulla ricerca traslazionale. Mentre l'attuale lavoro di Gwennan è ancora incentrato sulla fisiopatologia del GBM presso il laboratorio SOAP, la sua nuova missione come ricercatrice permanente dell'Integrated Center for Cancerology (ICO) è concentrarsi sulle vescicole extracellulari come nuovi potenziali strumenti diagnostici e/o predittivi per terapie innovative.

Le vescicole extracellulari da cellule staminali GBM rivestono un ruolo chiave nel glioblastoma

Come parte della loro ricerca sugli indicatori intra ed extracellulari del GBM, il gruppo ha sviluppato un particolare interesse per una sottopopolazione di cellule chiamate cellule staminali del glioblastoma (GSC).

Le GSC sono considerate agenti promotori della formazione e della progressione del glioblastoma e sono anche associate alla resistenza alla terapia nel GBM.5 Comprendere e sfruttare gli aspetti dei GSC, quindi, rappresenta una potenziale via da seguire per lo sviluppo di test e trattamenti diagnostici per il GBM. Pertanto c'è un grande interesse nello scoprire come le GSC interagiscono tra loro, nell'investigare il loro microambiente che promuove l'aggressività del GBM e la resistenza al trattamento.

Sebbene i meccanismi precisi siano ancora in fase di studio, le vescicole extracellulari sono state identificate quali componenti critici della comunicazione cellulare e della fisiopatologia – e il GBM non fa eccezione.6-8 Sono stati identificati diversi meccanismi potenziali; per esempio, le GSC secernono il fattore VEGF-A proangiogenico negli EV,9 e gli EV che trasportano microRNA specifici secondo quanto riferito mirano a RhoB e riducono l'apoptosi in vivo e in vitro.10

Per esplorare potenziali meccanismi di resistenza, il team ha ottenuto cellule staminali da resezioni tumorali di glioblastoma e le ha coltivate in presenza o assenza di temozolomide, un agente chemioterapico.11 In linea con l'osservazione che la temozolomide può incontrare resistenza da parte di alcuni tumori, il chemioterapico era appena tossico per le colture sferoidi di cellule staminali di glioblastoma derivate dal paziente. È interessante notare che l'analisi tramite Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS) del mezzo di coltura cellulare ha dimostrato che le concentrazioni di EV erano elevate quando le GSC venivano trattate con temozolomide, nonostante la temozolomide non avesse alcun effetto sulla vitalità cellulare. Un'ulteriore analisi delle vescicole extracellulari da GSC resistenti alla temozolomide derivate dal paziente ha svelato un arricchimento di vescicole extracellulari con carichi dedicati alle vie di adesione cellulare, aprendo la strada a nuove prospettive sul ruolo delle vescicole extracellulari nella chemioresistenza alla temozolomide e alla recidiva del tumore GBM.

Studiare le vescicole extracellulari come biomarcatori di glioblastoma

Oltre al ruolo delle vescicole extracellulari nella comunicazione all'interno dell'ambiente tumorale, la dott.ssa André-Grégoire è interessato al potenziale di queste vescicole come strumenti di informazione da biopsie liquide e possibili biomarcatori di recidiva e di tumori resistenti al trattamento. Alcuni dei loro primi lavori includevano misurazioni di ciò che viene chiamato "vesiclemia", cioè il numero di particelle per volume, nella circolazione di donatori sani e nelle persone con GBM.8

Il sangue dei pazienti con GBM conteneva una maggiore abbondanza di vescicole extracellulari, rispetto al sangue di donatori sani. Le ragioni di ciò sono sconosciute, afferma Gwennan: "Non stiamo dicendo che le vescicole extracellulari provengano dal tumore: potrebbero però essere un indicatore dello stato della malattia". Da notare che altri studi hanno anche riportato un aumento dell'abbondanza di EV con la malattia, incluso l'infarto del miocardio.12 Oltre alla quantità di EV, il contenuto di EV è stato esplorato anche nei singoli pazienti con GBM; recentemente, il fattore von Willebrand (VWF) è stato segnalato come un segno distintivo proteico selettivo per GBM, evidenziando il potenziale per le EV di riflettere lo stato individuale e i cambiamenti nell'omeostasi.13

I successivi studi di Gwennan su un modello murino di GBM hanno rivelato che la riduzione del tumore con una nuova terapia farmacologica riduce anche il numero di vescicole extracellulari circolanti nel flusso sanguigno.14 Questi risultati indicano un legame tra la "vesiclemia" e la presenza e le dimensioni dei tumori GBM.

Superare le sfide nell'isolamento delle vescicole extracellulari per supportare la ricerca sul glioblastoma
Il banco di lavoro del laboratorio, con l'Automatic Fraction Collector (AFC), il qEV Rack e il qNano di Izon

Il banco di lavoro del laboratorio, con l'Automatic Fraction Collector (AFC), il qEV Rack e il qNano di Izon

Con l'accesso ai campioni dei pazienti e ai modelli murini GBM, l'isolamento delle vescicole extracellulari è un aspetto importante del lavoro del gruppo. Il plasma contiene lipoproteine ​​e altri aggregati proteici che alterano gli studi sulla quantificazione e sul contenuto di EV. Per ottenere dati di alta qualità, quindi, è necessario prestare attenzione per garantire che i campioni siano sufficientemente purificati prima dell'analisi EV. Quando si lavora con il plasma, Gwennan utilizza le colonne qEV di Izon per separare i contaminanti solubili. Le colonne sfruttano i principi della cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e consentono la raccolta rapida (<15 minuti) di volumi di raccolta purificati contenenti EV intatte.

Per standardizzare la raccolta dei volumi di campioni purificati, il gruppo utilizza l'Automatic Fraction Collector (AFC) di Izon. L'AFC può essere programmato per raccogliere un volume di fluido desiderato nei tubi di raccolta che sono tenuti da un carosello integrato, consentendo all'operatore di occuparsi di altro nel frattempo, e garantendo una ridotta variabilità intra-operatore. La dott.ssa Gwennan ritiene che l'AFC possa essere un importante strumento da banco nella clinica una volta identificato un biomarcatore e stabilito un protocollo affidabile per la diagnosi di GBM basata su EV: "Utilizziamo il collettore automatico di frazioni qEV per standardizzare la procedura. Lo troviamo molto facile da usare e ci piace dire ai medici che se un giorno troveremo un biomarcatore, allora avremo già uno strumento disponibile", afferma la dott.ssa Gwennan.

Una volta ottenuti i volumi di raccolta purificati, le particelle vengono identificate utilizzando i marcatori di superficie CD9, CD63 e CD81, nonché le proteine ​​EV interne, come Alix e HSP70. La tecnologia TRPS di Izon viene utilizzata per le misurazioni delle dimensioni e della concentrazione, poiché il gruppo ha scoperto che questa tecnica è una soluzione accurata per la caratterizzazione delle vescicole extracellulari. Il dottor André-Grégoire sottolinea la necessità di una necessaria formazione come fattore importante per ottenere risultati di qualità.

Obiettivi per il futuro nel campo del glioblastoma

Gwennan spera che le vescicole extracellulari diventino una fonte principale di biomarcatori. Avere la capacità di identificare la cellula di origine significherebbe ottenere possibilità illimitate per la diagnostica e la ricerca di base: "Si pensa che le GSC siano responsabili delle proprietà aggressive del GBM. La speranza è che un giorno saremo in grado di utilizzare le vescicole extracellulari per rilevare ricadute precoci o resistenza al trattamento, per contribuire a fornire nei tempi migliori il giusto trattamento per i pazienti", afferma la dott.ssa André-Grégoire

La ricerca sulle vescicole extracellulari e in altre aree terapeutiche beneficeranno non solo dei progressi nelle tecniche in grado di rilevare le vescicole extracellulari con marcatori specifici, ma anche di tecniche standardizzate per la valutazione di dimensioni, concentrazione e altre caratteristiche fisiche. Nonostante i grandi progressi nell'analisi delle singole particelle, molti si affidano ancora a sistemi ottici classici che non sono adatti all'analisi quantitativa di campioni biologici polidispersi. Il lavoro della dottoressa André-Grégoire e dei suoi colleghi dimostra come analisi accurate delle le vescicole extracellulari possano fornire un quadro preciso e puntuale su processi fisiologici di importanza vitale, come la progressione del GBM.

Riferimenti

1. Bahadur S, Sahu AK, Baghel P, Saha S. Current promising treatment strategy for glioblastoma multiform: A review. Oncology Reviews. 2019;13(2). doi:10.4081/oncol.2019.417

2. Lan X, Jörg DJ, Cavalli FMG, et al. Fate mapping of human glioblastoma reveals an invariant stem cell hierarchy. Nature. 2017;549(7671):227-232. doi:10.1038/nature23666

3. Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, et al. Radiotherapy plus Concomitant and Adjuvant Temozolomide for Glioblastoma. New England Journal of Medicine. 2005;352(10):987-996. doi:10.1056/nejmoa043330

4. Jackson CM, Choi J, Lim M. Mechanisms of immunotherapy resistance: lessons from glioblastoma. Nature Immunology. 2019;20(9):1100-1109. doi:10.1038/s41590-019-0433-y

5. Chen J, Li Y, Yu T-S, et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 2012;488(7412):522-526. doi:10.1038/nature11287

6. Yekula A, Yekula A, Muralidharan K, Kang K, Carter BS, Balaj L. Extracellular Vesicles in Glioblastoma Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 2020;10. doi:10.3389/fimmu.2019.03137

7. André-Grégoire G, Gavard J. Spitting out the demons: Extracellular vesicles in glioblastoma. Cell Adhesion & Migration. 2016;11(2):164-172. doi:10.1080/19336918.2016.1247145

8. Sabbagh Q, Andre-Gregoire G, Guevel L, Gavard J. Vesiclemia: counting on extracellular vesicles for glioblastoma patients. Vol. 39, Oncogene. Springer Nature; 2020. p. 6043–52.

9. Treps L, Perret R, Edmond S, Ricard D, Gavard J. Glioblastoma stem-like cells secrete the pro-angiogenic VEGF-A factor in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 2017;6(1):1359479. doi:10.1080/20013078.2017.1359479

10. Yin J, Ge X, Shi Z, et al. Extracellular vesicles derived from hypoxic glioma stem-like cells confer temozolomide resistance on glioblastoma by delivering miR-30b-3p. Theranostics. 2021;11(4):1763-1779. doi:10.7150/thno.47057

11. André-Grégoire G, Bidère N, Gavard J. Temozolomide affects Extracellular Vesicles Released by Glioblastoma Cells. Biochimie. 2018;155:11-15. doi:10.1016/j.biochi.2018.02.007

12. Boulanger CM, Loyer X, Rautou P-E, Amabile N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 2017;14(5):259-272. doi:10.1038/nrcardio.2017.7

13. Sabbagh Q, André-Grégoire G, Alves-Nicolau C, et al. The von Willebrand Factor stamps Plasmatic Extracellular Vesicles from Glioblastoma Patients. Biorxiv. 2021. doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.25.437073

14. André-Grégoire G, Douanne T, Thys A, et al. The Necroptosis Effector MLKL drives Small Extracellular Vesicle Release and Tumour Growth in Glioblastoma. Biorxiv. 2021. doi: https://doi.org/10.1101/2021.01.12.426398

Prodotti correlati 

Ottieni una quantificazione rapida, accurata e precisa di nanoparticelle biologiche
Il primo sistema al mondo automatico e smart per l'isolamento di esosomi
qNano Gold - IZON Science
Misura dimensione, concentrazione e potenziale zeta di nanoparticelle, esosomi, vescicole, ecc...

Partner 

Izon Science